Il dipinto raffigura il momento della storia biblica in cui viene decapitato San Giovanni dal re Erode per soddisfare la sete di sangue del danzatore seducente, Salome. La scena è il cortile di una prigione e l'omicidio raccapricciante viene osservato da due altri prigionieri guardare attraverso una griglia, mentre una giovane donna e una vecchia pronti a prendere la testa mozzata e metterlo sul piatto d'attesa. Il sangue che scorre dal collo di San Giovanni gocciola verso il fondo del telaio e nel suo flusso di rosso, Caravaggio ha firmato il suo nome.

Sulla parete di destra l'oratorio è appesa una tela più piccola Caravaggio, San Girolamo, che è stato rubato nel 1984 e salvato in una operazione drammatica pochi mesi dopo. In esso, un uomo anziano seduto con una penna in mano.

Caravaggio è andato a Malta per evitare la pena di morte che erano state inflitte su di lui dopo aver commesso un omicidio a Roma e, con il corpo esangue di San Giovanni, sembra essere raffigurante la sua vittima e, al tempo stesso, la sua fine. Molti descrivono la pittura come il suo capolavoro.